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文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
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禾谷镰刀菌属子囊菌门植物病原真菌，
能够侵染小麦、玉米和大麦
等多种禾谷类粮食作物，引起赤霉病等严重病害。
禾谷镰刀菌不仅可导致粮食作物产量和品质的显著降低，还可产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇等真菌毒素。
DON可抑制真核生物蛋白质合成，具有较强的细胞毒性和免疫毒性，
导致呕吐、厌食、腹泻、神经紊乱和免疫抑制
等症状，严重威胁农产品质量安全与人畜健康。
农业生产防治赤霉病主要依靠杀菌剂，但随着病菌抗药性的增加，防治效果并不稳定，因此，挖掘禾谷镰刀菌侵染和产毒过程中的关键基因，深入了解其致病和产毒分子机制，对有效防治赤霉病及DON毒素污染具有重要意义。
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禾谷镰刀菌侵染和产毒过程
目前，
在哺乳动物中已发现20多个hnRNP，依次命名为hnRNPA至hnRNPU
，其中研究较多的成员包括hnRNPA、hnRNPB和hnRNPA/B等。
这些蛋白不仅在核酸代谢和基因调控等方面行使重要功能，也被证明参与多种癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等的发生和发展。
在酿酒酵母中，
Npl3、Hrp1和Nab2是研究较多的hnRNP
，这些蛋白同样被报道参与了RNA的加工、剪接和降解等，在多个水平上都发挥了重要的调控作用。
然而，关于hnRNPs的研究仍主要集中在哺乳动物和酿酒酵母中，其在丝状真菌中的作用仍鲜有报道。
在F.langsethiae和F.flagelliforme等镰刀菌中，hnRNPG已经得到了预测和注释，通过序列比对，
发现在禾谷镰刀菌中的同源蛋白由基因FGSG_07478编码
，有研究表明FGSG_07478可能参与了禾谷镰刀菌的子囊壳发育，但其它的生物学功能尚不清楚。
本研究基于同源重组原理和PEG介导的原生质体转化方法，获得禾谷镰刀菌基因FGSG_07478敲除突变体ΔFGSG_07478。
同源蛋白的获得和分析
从NCBI数据库中以FGSG_07478的氨基酸编码序列作为参照序列，利用NCBI-BLASTp的方法，查找其他物种中的同源蛋白。
挑选不同真菌的同源蛋白序列，
利用ClustalW进行多重序列比对处理，
并进一步利用MEGA11.0软件采用最大似然法构建遗传进化树，明确禾谷镰刀菌FGSG_07478和其他真菌同源蛋白的遗传进化关系。
将野生型菌株PH-1和突变体菌株ΔFGSG_07478于PDA平板上活化3d，用直径为7mm的打孔器在菌落边缘处打孔，将菌饼倒置接种于PDA培养皿上，于25℃黑暗条件下培养，运用十字交叉法每天记录菌落直径并计算生长速率。
每个菌株设置3个重复，菌落生长速率=/Δt，
其中L2为观察时间段结束时菌落直径
，L1为观察时间段开始时菌落直径，Δt为观察时间段的时间间隔。
基于基因同源重组原理，
采用split-PCR方法将FGSG_07478上游和潮霉素抗性基因
HPH上游片段H1、FGSG_07478下游和HPH下游片段H2分别进行融合。
采用PEG介导原生质体的方法将两个融合片段转化入野生型菌株PH-1，通过同源重组将禾谷镰刀菌目的基因FGSG_07478置换为外源潮霉素抗性基因HPH，达到基因敲除目的。
对利用潮霉素抗性初步筛选到的阳性转化子进行PCR验证，野生型菌株PH-1仅FGSG_07478基因可以扩增出条带，其余泳道均无条带。
而2个候选转化子中均可检测到FGSG上游-HPH上游融合片段
、HPH下游-FGSG_07478下游融合片段以及潮霉素抗性基因HPH，但无法扩增到FGSG_07478基因。
因此，可认为转化子中FGSG_07478已被HPH所置换，成功获得敲除突变体，此次试验共获得2个FGSG_07478基因的敲除突变体，2个突变体表型一致，选择其中一株突变体菌株用于后续试验。
禾谷镰刀菌的分生孢子被认为是侵染作物和病害循环的主要物质
，此项研究考察了野生型菌株PH-1和突变体菌株ΔFGSG_07478分生孢子的产孢量和形态。
结果显示，ΔFGSG_07478突变体可产生镰刀状分生孢子，每个孢子的隔膜数量均为3~7个，与野生型菌株PH-1相比，
ΔFGSG_07478突变体产孢量降低了约43.4%
，但孢子大小、形状和隔膜数量等方面均无明显差异。
因此，产孢量的下降可能是由于突变体生长缓慢导致。
禾谷镰刀菌有性生殖产生的子囊孢子是赤霉病发生的重要初侵染源
，本研究观察了FGSG_07478基因缺失的情况下对有性生殖的影响。
结果表明，突变体菌株ΔFGSG_07478可以形成黑色的子囊壳，但是形态偏小，数量也明显少于野生型菌株。
于载玻片压开子囊壳观察，野生型菌株PH-1和ΔFGSG_07478突变体菌株子囊和子囊孢子形态上没有明显差异。
因此，
基因FGSG_07478影响了禾谷镰刀菌子囊壳的发育
，但是并不影响子囊和子囊孢子，与之前报道的结果相一致。
FGSG_07478基因敲除对胁迫因子敏感性的测定
禾谷镰刀菌可以通过腐生的方式生存在自然环境中，
并受到外界各种胁迫因子的影响
，为考察FGSG_07478缺失是否影响禾谷镰刀菌对环境胁迫因子的敏感性。
此项研究分别考察野生型菌株PH-1和突变体菌株ΔFGSG_07478在渗透胁迫、氧化应激胁迫、细胞膜胁迫和细胞壁胁迫下的生长情况。
与野生型菌株相比，ΔFGSG_07478对H2O2和SDS等胁迫因子的敏感性显著增加，对刚果红的抗性显著增加。
因此，可以认为FGSG_07478在禾谷镰刀菌适应外界环境条件过程中发挥了重要的作用，
为了分析FGSG_07478在禾谷镰刀致病过程中的作用
，将野生型菌株PH-1、敲除突变体ΔFGSG_07478在小麦胚芽鞘上进行了致病力测定。
结果表明，接种胚芽鞘7d后，野生型菌株PH-1和突变体菌株ΔFGSG_07478均可导致小麦胚芽鞘产生明显的褐色坏死病斑，病斑长度无明显差异，致病力等级均为中等。
DON毒素是禾谷镰刀菌重要的致病因子之一
，本研究分别考察了，野生型菌株PH-1和突变体菌株ΔFGSG_07478在PDA培养基和大米培养基中生物合成DON的能力。
结果显示ΔFGSG_07478的产毒量显著低于野生型
，在PDA培养基和大米培养基中DON的产量分别下降了62.8%和74.7%。
进一步利用实时荧光定量PCR考察了FGSG_07478基因缺失对DON合成关键基因簇表达的影响，与野生型相比，ΔFGSG_07478中TRI4、TRI5、TRI6、TRI8、TRI10、TRI12和TRI101等基因的相对表达量均显著下调。
因此，FGSG_07478可通过调节禾谷镰刀菌中TRI基因的表达影响禾谷镰刀菌中DON毒素的生物合成。
禾谷镰刀菌引起的赤霉病是禾本类作物上的一种世界性重要病害
，不仅直接造成作物减产、品质降低，还可产生DON等真菌毒素，严重威胁粮食安全。
为有效防控赤霉病害和DON污染，
挖掘禾谷镰刀菌致病和产毒相关基因
，深入研究其分子机制，筛选关键防控靶位点已迫在眉睫。
作为RNA结合蛋白，hnRNP在RNA代谢的各个方面发挥着重要作用，但目前关于hnRNP的研究仍主要集中在哺乳动物和酿酒酵母中，其在丝状真菌中的作用尚未见研究。
hnRNPG是唯一能被糖基化的hnRNP，
不仅可作为剪接因子参与调控mRNA前体的剪接
，也可作为转录因子对细胞内全局性的基因表达产生多方面的影响，并在维持细胞稳态中发挥重要作用。
虽然hnRNPG在哺乳动物细胞中已有一定研究，但迄今为止其在真菌中的生物学功能仍几乎未知，在酵母中也未见关于hnRNPG的报道。
禾谷镰刀菌中FGSG_07478注释为假定蛋白
，生物信息学分析发现其与F.langsethiae和F.flagelliforme等镰刀菌的hnRNPG为同源蛋白。
此项研究利用基因敲除技术初步研究了FGSG_07478的生物学功能，发现FGSG_07478基因缺失后菌株生长速率显著变慢，但是菌丝形态无明显差异。
除hnRNP外，
SR蛋白也可以与pre-mRNA结合而参与调控RNA代谢
，有研究发现禾谷镰刀菌SR蛋白FgSrp2可通过与其他关键蛋白相互作用从而参与调控菌株生长，当其缺失后菌丝生长缓慢，但菌丝形态未受影响。
因此，推测FGSG_07478可能同样并非禾谷镰刀菌生长发育的关键因子，但行使了一定的调控作用。
FGSG_07478敲除后，突变体菌株的孢子形态没有改变，说明FGSG_07478并未影响细胞分裂，而产孢量的下降可能是由于突变体生长缓慢导致的。
在有性生殖方面，
ΔFGSG_07478突变体产生的子囊壳的数量和大小均低于野生型
，该结果与研究发现FGSG_07478缺失可导致禾谷镰刀菌子囊壳发育延滞相一致。
后者的另一项研究也发现在禾谷镰刀菌子囊壳发育过程中FGSG_07478的表达量随时间先上升后下降，特别在有丝分裂阶段基因表达量反而降低。
因此，
FGSG_07478可能并没有参与禾谷镰刀菌的有丝分裂调控
，但在子囊壳的发育中发挥了重要作用此外，与野生型菌株相比，突变体ΔFGSG_07478对外界、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫以及氧化应激胁迫的敏感性发生了变化。
表明FGSG_07478参与了禾谷镰刀菌抵御外界环境胁迫
，目前，FgHog1、FgMkk1和FgSR等蛋白已被证实为禾谷镰刀菌中相关胁迫信号通路的关键转录因子。
作为hnRNP，FGSG_07478可能调控了上述转录因子的mRNA代谢从而参与抵御环境胁迫，但该推测还有待进一步证实。
除参与营养生长、有性生殖以及抵御环境胁迫外，本研究还发现禾谷镰刀菌FGSG_07478缺失可引起DON产量的显著降低，
DON与禾谷镰刀菌在小麦穗轴上的扩展有关
，被认为是重要的毒性因子之一。
然而本研究却发现突变体ΔFGSG_07478致病力表现正常，这可能是因为虽然DON的产生对病原菌的侵染至关重要，但毒素产量与侵染能力并非一定呈现正相关。
即FGSG_07478缺失后，
禾谷镰刀菌DON产量虽然显著降低
，但并未失去产毒能力，导致致病力未发生显著变化。
在后续研究中，需进一步通过田间小麦穗接种等试验进行验证，以更全面的反映FGSG_07478在禾谷镰刀菌侵染作物和产生DON中的作用。
TRI基因是DON等单端孢霉烯族真菌毒素生物合成的核心基因簇，其中TRI6和TRI10为转录因子，可调控其他TRI基因的表达。
FGSG_07478敲除后
TRI4、TRI5、TRI6、TRI8、TRI10、TRI12和TRI101等TRI基因
的表达均显著下调，在哺乳动物细胞中，hnRNPG已被报道可参与全局性的基因表达调控。
因此，
FGSG_07478可能通过直接或间接调控TRI基因的表达
，从而影响禾谷镰刀菌中DON的生物合成，但具体调控机制还需深入探究。
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