研 究 背 景

最近几年，植物不断受到各种环境胁迫的挑战，尤其是干旱、盐度和温度。

这些非生物胁迫通过影响植物发芽生化、生理和分子活动来阻碍植物生长，从而导致作物生产力严重损失，尽管如此，一些植物物种缝在适应，并通过各种机制的综合网络（如诱导型启动子激活基因）来对抗压力。

启动子是基因表达的关键调节剂，它是由转录因子 (TF) 识别的上游基因调控序列，参与控制转录起始和进程。

在现代作物改良策略中，高效基因构建体的设计依赖于启动子效率、组织特异性和其他允许农艺学相关性状渗入以克服生物和非生物胁迫的特性。

pCaMV35S是广泛用于转基因植物开发的启动子，也有其他作用，例如基因沉默和影响植物适应性的代谢惩罚，组成型启动子一直引起不必要的高基因表达，从而干扰植物发育的其他细胞途径。

CaMV 35S 启动子在不同植物物种间、组织间和组织内以及不同环境条件下的基因表达模式的变异性已得到例证，通过在 35S 启动子下过表达基因进行的转录后和翻译沉默已得到充分记录，还回顾了 35S 启动子的优缺点及其将其用作首选启动子的局限性。

为了规避组成型启动子的负面影响，植物来源的胁迫诱导型启动子的鉴定和功能表征成为关注的焦点，作为在胁迫下驱动基因表达而不对植物生长产生负面影响的替代方案。

基于某些刺激导致基因暂时表达的诱导型启动子，能够消除组成型启动子的负面影响，它们用于在某些胁迫条件下表达胁迫耐受基因，例如干旱、高温、寒冷、脱水和氧化环境。

在转基因拟南芥中应激诱导 AtRD29A 启动子下AtDREB1A的过表达水稻对非生物胁迫的耐受性提高，植物生长无异常。

诱导型启动子在不同胁迫下的高水平表达：来自玉米的盐度和渗透胁迫诱导型 GAPP 启动子、珍珠粟的热诱导型，菊花的渗透压和冷胁迫诱导型 B BX24， 启动子拟南芥的干旱胁迫诱导型启动子 RD29A 和 RD29B，以及来自小麦的渗透胁迫诱导DREB2、DREB6和Wdreb2。

在表征的各种非生物胁迫启动子中，AtRD29A 启动子是在干旱胁迫下具有更强活性的主要启动子，因此，它已成功用于驱动不同植物物种中耐旱基因的表达。

枣椰树（Phoenix dactylifera L.）是槟榔科重要的果树，是多年生雌雄异株单子叶植物，广泛栽培于北非和中东的干旱半干旱地区，它对干旱和半干旱地区的适应性很强，特别是能够承受从 56 到 60˚C 到零下几度的温度波动。

植物材料和启动子片段的克隆

启动子片段被克隆到植物转化质粒载体 pCAMBIA1391Z 的gusA报告基因的上游。

gusA基因有一个带有过氧化氢酶内含子的 5 延伸，以确保在植物而非细菌中表达，该质粒具有选择细菌卡那霉素 ( nptI)抗性和植物潮霉素 (增强型 35S: hpt ) 抗性的基因。

使用T4 DNA 连接酶，将从 pCR®-Blunt II-TOPO® 载体中用EcoR1和Avrll限制酶消化的启动子片段，连接到含有用相同酶消化的gusA基因的 pCAMBIA1391Z 载体中，以构建植物转化载体pCAMBIA1391Z-P DREB1G -1.6 ::GUS命名为 DF 和 pCAMBIA1391Z- P DREB1G-880 :: GUS命名为 DS。

质粒载体 pCAMBIA1391Z- P RD29A :: GUS（以下称为 RD29A）是通过连接上述 RD29A 启动子的消化片段而开发的，通过化学转化法将连接的质粒转化为DH5α。

DS、DF、RD29A 以及 pCAMBIA1391Z-35S：GUS的重组质粒，被转移到解除武装的超强毒力农杆菌菌株 EHA105 中， 通过电转化选择的阳性菌落用于烟草转化。

为了表征和阐明 ，我们PdDREB1G 启动子对不同非生物胁迫的响应，对 DS、DF、RD29A、35S 和未转化的小植物 (WT) 的 25 日龄转基因 T 3小植物（各三个品系）和未转化的小植物 (WT) ，进行 150 mM NaCl， 10%（w/v）PEG6000、20 µM ABA、10 µM SA、4 °C 24 小时实验。

对于所有压力实验，使用 Microsoft Excel 程序分析基因的相对表达和标准误差值，数据值表示来自三个独立实验的平均值±SE，进行学生 t 检验以评估控制和治疗条件之间的显着差异，P < 0.05 的差异被认为是显着的。

PdDREB1G 启动子序列的生物信息学分析

从海枣cv的基因组 DNA 中分离出位于PdDREB1G起始密码子 (ATG) 上游的 1.6 kb 片段 (DF) 和 880 bp 片段 (DS) ，使用 PLACE 和 PlantCARE 对启动子序列的分析显示出许多非生物胁迫响应顺式元件。

比较了 DF、DS 片段和 RD29A 中与非生物胁迫相关的顺式元素的频率。结果表明，启动子序列包含多个缺水响应顺式-作用元件，例如 EBOXBNNAPA (CANNTG)、DRE1COREZMRAB17 (ACCGAGA)、ABRELATERD1 (ACGTG)、ACGTATERD1 (ACGT)、MYB2AT (TAACTG)、MYBCORE (CNGTTR)、MYB1AT (WAACCA)、MYB2CONSENSUSAT (YAACKG)。

G-box (CACGTG) 和富含 TC 的重复序列 (GTTTTCTTAC) 负责脱水和耐盐性。LTRECOREATCOR15 (CCGAC) 代表低温耐受性。DF 片段包含一个 SA 响应 TCA (CCATCTTTTT) 元素。

在 DF 和 DS 片段中，负责早期脱水基因激活的 ABRE 元件数量分别为 11 和 10，EBOXBNNAPA 用于脱水，ABA 响应元件在 DF 区域有 9 个，在 DS 片段有 3 个。

DF 中的两个 G-box 区域和 DS 中的一个区域负责脱水、高盐度和 ABA 反应，在 DF 片段中有两个 DRE1COREZMRAB17 和富含 TC 的重复序列，在 DS 片段中各有一个，这对干旱和耐盐性具有重要意义。

启动子序列显示两个位于DS区的冷响应LTR元件，DF 中有两个 MYBCORE 和一个 MYB2AT 区域，DF 和 DS 片段中各有一个 MYB1AT 区域，这对脱水应激反应很重要。

与 RD29A 启动子相比，在叶子的情况下，DS 的表达在盐胁迫下高三倍，DF 高两倍。PEG 和 ABA 的 DS 高两倍，DS、DF 和 RD29A 在 SA 和冷胁迫下没有显着差异。

在根部的情况下，gusA基因在 DS 中的表达在盐中高四倍，在 PEG 和 ABA 中高三倍，在 SA 中高两倍，并且在冷胁迫下没有显着差异，与 RD29A 启动子相比，DF 对gusA基因的表达没有显示出显着差异。

枣椰树是干旱地区广泛栽培的果树之一，其耐受各种非生物胁迫的基因和机制尚不清楚。对来自海枣的DREB1G基因启动子片段的功能分析揭示了多个顺式作用元件，这些元件以应激诱导和组织特异性方式调节转录，DREBs是属于含有保守AP2/ERF结构域的AP2/ERF转录因子家族的重要转录因子，进一步细分为A-1至A-6的六个亚组。

这些 DREB 与 CRT/DRE顺式结合- 启动子中的元件 (A/GCCGAC)，其调节基因在植物对生物和非生物胁迫的耐受性中发挥关键作用。现在证明，大多数DREB基因都受到非生物胁迫的调控，这种诱导可能是ABA依赖的，也可能是ABA非依赖的。

此外，DREB1/CBF 型转录因子被四种或更少的主要非生物胁迫（冷、热、干旱和盐度）激活，尽管不同物种中直系同源基因的表达模式各不相同。

结 论

在这项研究中，我们比较了 PdDREB1G 启动子片段的名为 DF 的长 (1.6 kb) 和名为 DS 的短 (880 bp)，以找出在非生物胁迫下获得更高活性的最佳启动子长度，保留众所周知的干旱 AtRD29A 启动子作为阳性对照进行比较。

顺式元件筛选表明，PdDREB1G启动子片段富含与盐度、脱水、ABA和温度相关的胁迫相关顺式元件，该结果与启动子在盐度、脱水和 ABA 处理下的优异性能直接相关。

可以得知在干旱地区，生长良好的枣椰树等重要农艺植物的反应验证，启动子对于开发具有改良抗逆能力的转基因植物具有重要意义。