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Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
机理图图1. CCK-8检测原理图
1）制备细胞悬液，计数。
2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。
3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO2），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。
4）每孔各加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡。
5）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。
6）酶标仪测定450nm处的吸光值（OD）。
7）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温下避光保存，这样可以保证OD值在24h内不发生变化。1）制备细胞悬液，计数。
2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。
3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO2），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。
4）向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质）。
5）将培养板放入培养箱中孵育一段时间，例如6、12、24、48h，具体时间要看待测物质的性质和细胞的敏感性。
如果待检测物质有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。
7）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。
8）用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。
9）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温避光保存，这样可以保证OD值24h内不发生变化。细胞活力（%）=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值
A（空白）：没有细胞的孔的OD值
细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。
2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致。
3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基。
4. 建议采用多通道移液器，减少平行孔间的误差，加 CCK-8 时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰 OD 值。
5. 若细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 发生变化，建议更换培养基后再加 CCK-8，含有酚红的培养基不影响测定。
6. CCK-8 对细胞的毒性非常低，其他的实验，例如中性红法或结晶紫法 ，也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。
7. 可以使用大于 600 nm 的波长，例如 650 nm，作为参考波长进行双波长测定，CCK-8 在参比波长处没有吸光值，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂，在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较 （只加 CCK-8 试剂），如果 OD 值明显偏高，则说明有反应。
9. 加 CCK-8 试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差，可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。
10. CCK-8 反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。11.接种细胞数：针对标准96孔板，贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞，接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。如若使用24孔板或6孔板，应预先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
11.CCK-8 反应时间：悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色，因此需要增加细胞数量并延长CCK-8反应时间。另外，在培养箱中孵育期间，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。另外，如果细胞培养时间较长导致培养基颜色发生了变化，应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8进行检测。
12.空白对照：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度即为空白对照。在细胞毒性实验中，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。13.测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
13.如果待测物质有氧化还原性，可在加 CCK-8 之前更换新鲜的培养基，去掉待测物质的影响。
细胞存活率 = [（实验孔 — 空白孔）/ （对照孔 — 空白孔）] × 100%抑制率 = [（对照孔 — 实验孔） / （对照孔 — 空白孔）] × 100%
实验孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质）对照孔 （含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质）空白孔 （不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8）☆ CCK 的保存和稳定性如何？
答：CCK 稳定性高，避光条件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。经常使用建议 4℃ 保存，避免反复冻融。CCK 正常颜色为粉红色，若颜色发生明显偏差，质量可能有发生变化。
☆ CCK 会对活细胞进行染色吗？
答：不会，首先 WST-8 不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。
☆在加入 CCK-8 时可否不更换培养基？
答：一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。
☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验，CCK 试剂使用量怎么样呢？
答：如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。
☆ 能否用 384 孔板进行细胞增殖与活性检测的实验呢？
答：可以，CCK-8 产品的使用量为每孔培养基总体积的 10%。建议先将 CCK-8 产品稀释一倍，然后加入培养基总体积的 20% 即可，这样可减少误差。
☆ 只可以在 450 nm 波长处测 OD 值吗？
答：可以在 450 nm 波长处测 OD 值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在 430~490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度最高。
☆ 若是暂不检测 OD 值，该如何处理？
答：若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化
☆ 在实验中 OD 值太高，怎么解决？
答：可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。
☆ 如果 OD 值太低，怎么解决？
答：可以采取 2 个办法：1、适当增加细胞数量；2、延长加入 CCK-8 试剂后的反应时间。
☆ 应该每次做标准曲线吗？
答：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。
祝大家科研顺利，欢迎补充！
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