抗体药物偶联物的稳定性和制剂

预计未来几年市场上的抗体-药物偶联物（ADC）数量将成倍增加。主要原因：这种新颖的药物递送系统结合了抗体的选择性和细胞毒剂的功效。但是，抗体，接头和有效负载之间的相互作用需要稳定且独特的制剂方法。在这篇综述中，总结了有关市售ADC稳定性和各自配方的文献，并以此为基础给出了ADC的一般配方考虑因素。抗体配方中使用相同的赋形剂，而ADC赋形剂的离子强度和浓度要特别集中。此外，还包括分析工具的简短概述，以表征ADC配方。

什么是抗体-药物偶联物？

在癌症治疗中使用抗体已导致治疗的可能性大大增加。抗体由于分别选择性地与抗原或抗原阳性细胞结合而显示几乎没有靶向毒性。 然而，抗体通常不足以有效对抗肿瘤。抗体-药物偶联物（ADC）结合了抗体和细胞毒性剂的优点，从而增强了杀死肿瘤细胞的功效和选择性。一旦抗体特异性结合细胞的靶受体，ADC就可能被内化并释放出细胞毒性剂，导致细胞死亡（图1）。 ADC因此可以被认为是先进的药物输送系统。这个概念已经在1970年代讨论过，但是在1980年代的初期试验中，以b96-阿霉素和去乙酰长春花碱为有效成分，然而最后失败。

自从2000年批准Mylotarg®（吉非单抗ozogamicamicin），后来批准了Adcetris®（非伦妥昔单抗vedotin），Kadcyla®（曲妥珠单抗emtansine），以及最近的Bespona®（伊诺单抗ozogamicin），ADC蓬勃发展。销售额预计会成倍增长，因为2015年市场价值为13亿美元，预计到2022年将增长到293亿美元。当前，至少有80个ADC正在临床开发中，其中大多数仍处于试验阶段。在前期试验的9个ADC中，FDA已授予其中7个突破性疗法称号。不同的因素挑战了这种有效载荷输送系统的成功，例如：有效载荷内在化为完整的ADC，肿瘤组织上靶抗原的表达，细胞内和细胞外接头的稳定性以及针对肿瘤的正确有效载荷。

关于抗原结合，ADC应该像亲本抗体一样起作用。缀合可以改变抗体的药代动力学，从而改变其药理特性，例如曲坦单抗的平均半衰期从与坦丹宁缀合后的28.5天减少到6天。ADC的药代动力学主要由抗体决定，但也受接头，有效负载以及缀合本身的影响。由于与抗体降解相关的解偶联作用，已证明与mAb清除相比ADC清除速度更快。如果ADC机制中的每一步都有效50％，则只有1.56％的有效载荷到达目标细胞。假定实际摄入量甚至更低。通常需要折中每种抗体的药物数量，以实现抗体的最高可能的细胞毒性和最高的稳定性。考虑使用两种至四种药物的每种抗体以产生最佳治疗窗口。此外，较大的药物有效载荷（例如细菌外毒素）可能会干扰抗原/ Fc受体的结合。如已在较大的PEG部分中观察到的，与受体的结合可能会减少。

1. ADC的特定组件

在开发市场上有效的临床有效单克隆抗体（mAb）或ADC的过程中，需要开发稳定的制剂。蛋白质容易发生化学和物理降解。药物缀合为抗体引入了更多的复杂性和不稳定性方面。在下文中，将讨论每种组分和整个ADC分子的稳定性考虑因素。

1.1抗体成分

尽管Rituxan®作为第一种可商购的mAb直到1997年才获得批准，但MAb的表征却相当广泛。到目前为止，由于它们在肿瘤处的蓄积和长的循环半衰期，仅将完整的IgG分子用于ADC的开发。ADC可以想到其他抗体形式，但尚未在临床中进行测试。这些可以包括片段，例如单链Fv片段或小抗体。例如，对于实体瘤，使用双抗体和小抗体可能会增加肿瘤的穿透性。此外，在临床前研究中已经测试了针对HER2和CD63的双特异性ADC。遵循mAb的普遍趋势，大多数ADC都是基于人源化或完全人源化的序列。此外，由于大多数有效负载被设计为在细胞内释放，因此ADC中使用的抗体通常应在结合靶标后内在化。临床前，Gébleux等已有研究表明，具有非内在化抗体的ADC也可以显示有效的抗癌活性。

结合后保留母体mAb的高免疫力对于产品至关重要。为了缀合，已经使用了抗体的各种官能团。这些是链间半胱氨酸残基（硫醇），胺（赖氨酸），醇，醛和叠氮化物。游离巯基可能会降低mAb的稳定性，但是链间半胱氨酸的降低不会对抗体的稳定性产生负面影响，并且是最早使用的缀合方法之一。半胱氨酸连接的ADC在药物负载和结合位点方面是异质的，因为每个抗体可能有0至8种药物。为了提高同质性，已经通过一级结构中的半胱氨酸取代引入了不改变IgG功能的反应性硫醇基团，这些取代基被称为ThioMabs。

通过添加接头修饰表面赖氨酸残基可中和这些残基上的正电荷。据报道，赖氨酸偶联可导致每个抗体多达八种偶联药物，尽管理论上可能更高。在结合了赖氨酸的ADC中，几乎50％的赖氨酸被部分修饰，特别是在具有高柔韧性和溶剂可及性的区域。因此，与半胱氨酸连接的ADC相比，赖氨酸连接的ADC的异构性更高，但与幼稚mAb的差异较小。为了更好地控制赖氨酸偶联ADC的载药量和特异性，已进行了研究，仅针对最易接近溶剂且反应性强的赖氨酸。进一步的技术如酶促偶联，通过使用非天然氨基酸进行偶联，例如 对乙酰基苯丙氨酸和通过其他聚糖的特定位点缀合正在开发中。

1.2 链接器组件

接头在过程化学，等离子体循环和产物存储中的稳定性对于ADC至关重要。此外，有效载荷必须对内源性反应分子呈惰性，并且必须在靶标处释放。接头的选择也会影响抗原和Fc受体的结合以及热稳定性。

在文献中对不同的接头进行了很好的综述。简而言之，接头可分为化学不稳定的，酶不稳定的和不可裂解的。化学不稳定的连接子通过依赖pH的机制裂解，这意味着它们对溶酶体的酸性pH敏感。一个例子是Mylotarg®和Besponsa®（图2）中使用的the连接子。与pH 5.0（t1 / 2 3h）相比，在pH 7.2下，连接基相对稳定（t1 / 2> 60h）。由于还可在溶酶体之外的体内发现酸性条件，因此可能发生非特异性药物释放。Mylotarg®暂时停药的原因之一是其在血浆中的不稳定性。使用酶不稳定的接头增加接头的稳定性，所述酶不稳定的接头被溶酶体蛋白酶切割。已使用缬氨酸-瓜氨酸二肽接头成功地为Adcetris®实现了这种连接。具有不可裂解的接头的ADC被内化，抗体被降解。对于不可裂解的接头，游离药物的非靶向释放减少，从而降低了全身毒性。有效使用的一个例子是带有4-（N-马来酰亚胺甲基）环己-1-羧酸琥珀酰亚胺基（SMCC）接头的Kadcyla®。药物和接头共同起有效的细胞毒性作用。接头的最佳选择还取决于靶抗原，靶抗原应位于细胞表面附近以使ADC结合。文献中还讨论了新形式的疏水性更弱的接头，该接头能够使每个抗体结合更多数量的疏水性有效负载。链接器本身的稳定性不属于本评价的一部分，读者可参考其他出版物。

接头的选择决定了药物与抗体的比例（DAR），药物负载分布和连接的稳定性，这对产品质量至关重要。此外，残留或解离的游离药物的分析对于毒性和安全性评估很重要。例如，如果附近有其他硫醇且其疏水性可能会增加蛋白质聚集，则在生理pH和温度下，经常使用的硫代琥珀酰亚胺连接基可以进行逆向和交换反应。

1.3 有效载荷部分

被选作ADC的有效载荷的药物具有很高的细胞毒性，并以有效形式从ADC释放出来。有效载荷和最终的代谢产物形式决定了ADC分子的毒性。在ADC的第一个时代，释放的有效负载分子与游离药物不同，这导致ADC的效力降低。当前的ADC有效载荷分为两类：以DNA为目标的有效载荷和以微管蛋白为目标的有效载荷。在临床试验中使用的靶向DNA的有效负载是加利车霉素，吡咯并苯并二氮杂二聚体，杜卡霉素和吲哚并苯并二氮杂二聚体。靶向微管蛋白的有效载荷是抗有丝分裂的，例如耳他汀和美登木素生物碱。由于实际达到目标的ADC的百分比较低，因此释放的药物的效力必须足够高才能杀死肿瘤细胞（> 106分子/细胞）。

有效载荷通常对传统化学疗法毒性太大，对肿瘤细胞的选择性通常很小。例如，DNA烷基化剂，如杜卡霉素和吡咯并苯并二氮杂已重新引入研究开发，目前正在评估新的高效药物。基于Emtansine和vedotin的有效负载的典型物理化学特性（图2）是分子量约为700–750Da，H供体和受体之和约为15，log P约为10。四。如McCombs等人所述，如果溶解度，缀合性和稳定性足够高，则药物适合作为ADC的有效负载。例如，亲脂性有益细胞膜，在水缓冲液中的缀合也是必要的。疏水性也可能影响ADC的稳定性（请参见第1.4节），使用亲水性连接基可以减少对ADC本身的疏水性影响。此外，药物必须具有能够结合的官能团，但不会影响药效。如前所述，美登木素生物碱被用作ADC的有效载荷。增加一个功能基团以实现连接的挑战导致人们对该部分进行了研究，可以修改哪个位置以及哪个官能团。最后，发现一个确定的位置足以添加一个新的包含侧基硫醇基团的酯侧链。除末端硫醇基团外，还考虑了前药，例如氯甲基，氨基甲酰基，肽基和碳酸酯衍生物。

1.4 ADC注意事项

DAR影响ADC特性，因为它决定ADC的效率和稳定性。如果选择的DAR太低，则细胞毒性不足。如果选择的过高，则ADC可能会被免疫系统识别，也可能被更多的酶促聚集。考虑到两个至四个的ADAR是最优的。对于特定的ADC，需要通过实验确定最佳的DAR，以确定其稳定性，体内功效和药代动力学。例如，Sun等发现，尽管效力随着DAR的增加而增加，但只有DAR大于6的ADC才显示出更快的清除率。Hamblett等发现DAR与血浆清除率之间存在明显的相关性。偶联本身可能会诱导抗体分子的结构变化，进而可能影响其他生物物理特性。构象和胶体不稳定性会诱导蛋白质聚集，这可能导致效率和免疫原性丧失。

Ross和Wolfe最近回顾了ADC的物理和化学稳定性。在有效负载的半胱氨酸连接后，蛋白质构象没有显着改变，但展开的构象能量减少，并且产生了疏水的局部表面。相应地，可以降低熔融温度并触发聚集体形成。具有较高DAR的分子更易于聚集，并且混合物中较高的DAR种类决定了ADC整体的稳定性。在最近的出版物中，mAb的去稳定化与代数DAR为8的替代ADC的有效载荷疏水性直接相关。半胱氨酸连接的ADC的热稳定性随着DAR的增加以及离子强度的增加而大大降低。即使抗体仅在Fab区中缀合，与Fab / CH3域相比，CH2区的融解温度也会受到结合的影响。

关于赖氨酸连接的ADC稳定性的文献很少。结合后，赖氨酸的正电荷被去除，并生成多种同工型。在40°C下储存7天后，ADC及其抗体连接物中间体的熔化温度降低，较高分子量物种的百分比增加。Wakankar等。也显示了共轭对CH2结构域的影响最大，这可以用CH2域的高灵活性和增加的共轭可能性来解释。有趣的是，单独添加链接器比添加链接器和有效负载都增加了聚合。未缀合的接头可能与亲核氨基酸的侧链反应导致聚集。疏水有效载荷和不均匀的电荷分布增加了赖氨酸连接的ADC的聚集倾向。与Herceptin相比，已证明Kadcyla®的胶体稳定性降低。与硫醇缀合物相比，通过赖氨酸的缀合，Fab结构域的稳定性降低的幅度较小。Mohamed等人最近比较了pH，温度，搅拌和冻融循环对曲妥珠单抗和相应赖氨酸连接的ADC（T-DM1）稳定性的影响。与母体mAb相比，在热和机械胁迫以及pH胁迫下，T-DM1的降解增加。Kadcyla®与生物仿制药的比较显示出相当的热稳定性和聚集行为，尽管DAR略有差异。

ADC的化学稳定性取决于母体mAb，接头有效载荷的不稳定性以及抗体上的结合位点。例如，硫醚琥珀酰亚胺键可在温和的水性环境中氧化，然后消除亚砜。对于结合过程，必须考虑抗体，接头和有效负载的不同物理和化学特性。例如，抗体在加水的水溶液中更稳定，而有效载荷通常具有有限的水溶性。结合过程中有机溶剂的必要使用可能会使抗体不稳定。此外，应在与偶联步骤兼容的pH值的缓冲液中提供mAb。偶联过程中的副反应可能使抗体不稳定，例如不仅与赖氨酸反应，而且与半胱氨酸和酪氨酸反应的琥珀酰亚胺酯。此外，含有伯胺的缓冲剂例如组氨酸，不能用于基于赖氨酸的偶联。为了患者的安全，未结合药物和残留有机溶剂的清除也是必不可少的。

2. ADC的配方注意事项

蛋白质的结构多样性要求为每种产品开发独特而特定的配方，这可能会非常耗时。对于ADC，最佳配方不仅取决于mAb的稳定性，而且还必须考虑连接子和有效负载的化学稳定性。用于ADC和免疫偶联物的制剂汇编。表1和表2分别给出了2018年9月的市场。当前的ADC市场被用作以下配方考虑的基础。

2.1产品的关键因素

市售ADC的浓度低于20mg/mL（表1）。这与文献中针对传统mAb治疗剂广泛讨论的高于50mg/mL的浓度形成明显对比。ADC对肿瘤细胞杀伤以及静脉内注射具有很高的选择性和功效。应用避免了使用高浓度的必要性。较低的浓度会降低聚集的风险，尤其是对于携带疏水性有效负载的mAb。这是一个重要的优点，因为与净母体mAb相比，ADC的溶解度可能会降低，这是因为净表面电荷的损失和有效负载的亲脂性。

市场上的ADC以输液形式提供。在输液袋中，ADC浓度低，由于吸附到塑料上会增加药物流失的风险，而疏水性有效载荷可能会增加药物流失的风险。稀释药物也会降低稳定剂的水平，这可能会导致聚集和颗粒形成。在0.9％的NaCl溶液中，静电屏蔽可能会增强蛋白质与蛋白质之间的吸引力，从而导致高DAR物质的溶解度降低或聚集趋势增加。0.9％NaCl和5％葡萄糖输注溶液均呈弱酸性，并且取决于ADC制剂的稀释倍数，pH和缓冲容量，尽管ADC制剂通常也呈弱酸性，但可能会发生pH改变，从而改变ADC分子的电荷状态。

具有低离子强度的配方已显示出可减少ADC的聚集和破碎。特别是对于赖氨酸连接的ADC，表面电荷分布不均匀。在传统的单克隆抗体中，电荷分布不一致的分子预计会更倾向于分子间吸引。DAR分布和高DAR种类强烈影响ADC的稳定性和配方组成。此外，选择合适的pH值不仅会受到ADC的IEP的影响，而且还会受到水解的影响。pH值升高会刺激硫醇-琥珀酰亚胺接头的水解。冷冻干燥的制剂可以减少接头在储存过程中的水解降解。

对于生物制药，首选液体制剂，2013年在日本和美国，约有2/3的市售产品为溶液。首选液体溶液的原因是与冻干剂相比，其成本更低，便利性更高。但是，产品可能会遇到稳定性问题。迄今为止，所有经过批准的ADC均被冻干并与糖和表面活性剂一起在啤酒中配制（表1）。仅免疫缀合物以液体或冷冻溶液的形式出现（表2）。到目前为止，与冻干状态相比，没有出版物关注液体中ADC的稳定性。显然，冻干可大大降低化学降解，特别是游离药物形成的风险。例如，Adcetris®和Kadcyla®中的硫代-琥珀酰亚胺键可通过琥珀酰亚胺水解或逆迈克尔反应而降解。Besponsa®和Mylotarg®中使用的键非常不稳定，并在血浆中缓慢水解。有趣的是，与传统的单克隆抗体疗法相反，ADC可能对光敏感，而Mylotarg®和Besponsa®装在琥珀色玻璃小瓶中。

2.2 ADC配方成分

ADC制剂与mAb制剂基于相同的赋形剂。缓冲液的选择取决于目标pH，ADC的不稳定性分布以及是否关注液体或冻干形式。对于高浓度mAb解决方案，最近讨论了无缓冲剂的配方，但这对于不稳定的ADC可能不是一个选择。当将ADC混合到输液中以进行应用时，例如0.9％的氯化钠或5％的葡萄糖溶液（表1），ADC制剂的等渗性是不必要的。尽管如此，张度剂如氯化钠，甘露醇或蔗糖仍被添加到ADC配方中。糖，特别是蔗糖和海藻糖，可作为冻干ADC的冷冻保护剂和冷冻保护剂。冷冻期间糖的浓度可能需要高达5％（w / v），而干燥状态下糖与蛋白质的重量比至少为1：1是必需的。随着下一代现场专用ADC的使用，治疗剂量可能会增加，而DAR可能会更低，可能不需要糖。表面活性剂，特别是聚山梨酯20或80，可用于mAb以及ADC配方中。聚山梨酯可能降解，包含杂质，是不均匀的混合物，并且难以表征。但是，由于表面活性剂可稳定蛋白质以防止其在界面上的积累和聚集，并且在重构过程中可能会增加润湿性，因此它们的积极作用占了上风。与mAbs相比，由于药物的异质性和疏水性，ADC可能需要更高的聚山梨酸酯浓度。为了减少有效载荷的疏水性影响，建议使用具有表面活性剂的低离子强度缓冲剂。ADC显示出更明显的聚集体形成，并在较高的离子强度下具有较低的Tm，并且与盐的类型无关。

3. ADC的分析

ADC的市场认可取决于长期存储期间已证明的稳定性和保持的生物学活性，以及蛋白质可能会遇到的压力。 传统mAb使用的分析工具箱也适用于ADC（图3）。 但是，并非所有方法都可以不做任何修改就转移到ADC，例如 如果有效载荷显示紫外线吸收或样品高度不均匀。 尤其是对于通过赖氨酸和半胱氨酸结合化学方法获得的ADC，所得药物是高度异质的。 由于这可能会影响药物的安全性和有效性，因此目标产品配置文件通常包含DAR和同质性指标，以控制产品质量并确保不同批次之间的一致性。 仍然缺乏稀缺的ADC分析并正在开发中。 在下文中，将简要描述一些针对ADC的特殊考虑的分析。

DAR可以通过UV / Vis光谱法进行测量，但前提是有效载荷和抗体之间的最大吸收差异较大。确定DAR，药物负荷分布和游离药物的其他方法是疏水相互作用色谱法和LC-ESI-MS。肽图分析可用于鉴定可能由结合和降解引起的特定蛋白质修饰。传统上未结合的药物是使用RP-HPLC测定的，但也已使用CE和ELISA。一些表征技术需要适应ADC，例如 在SEC中，由于疏水有效载荷而导致与色谱柱的更强相互作用可能必须通过添加有机溶剂来降低。此外，用于确定动态扫描荧光法中Tm的外在荧光染料SYPRO®Orange可与疏水性有效载荷相互作用，从而阻止了其在ADC中的适用性。

4．结论

可以从ADC的常规抗体概念中采用各种预测稳定性和找到最佳制剂的方法。然而，ADC不仅是抗体，而且还具有两个小分子，即连接子和有效负载，它们需要与抗体连接。迄今为止，只有四个ADC已获得FDA或EMA的批准，其稳定性和配方方面的公开知识非常有限。因此，我们建议所有配方科学家认真开发ADC配方，并严格监控开发和加工各个阶段的稳定性。例如，液态连接子和有效负载的不稳定性可能会抑制目标冻干ADC作为液体在加速条件下的分析。这需要用于ADC的新的高吞吐量稳定性指示方法。同时，计算建模方法为早期ADC候选人选择和高级理解提供了极有价值的工具。