文 | 万物喵知道

编辑 | 万物喵知道

☾↢研究背景↣☽

纳米技术能够以1纳米的水平对物质进行控制操作。这实际上意味着在原子和分子尺度上控制物理、化学和生物过程。发明了用于体内药物和生物活性物质的靶向运输的方法和工具，以及用于快速分析的主动诊断装置。

阿霉素是一种蒽环类药物，提取自标致链霉菌var。20世纪70年代的凯撒大帝。多柔比星在癌细胞中的作用机制有两种：(I)嵌入DNA并破坏拓扑异构酶-II介导的DNA修复和(II)自由基的产生及其对细胞膜、DNA和蛋白质的损伤。

图1

简而言之，多柔比星被氧化成半醌，这是一种不稳定的代谢物，在释放活性氧物种的过程中被转化回多柔比星。活性氧可导致脂质过氧化和膜损伤、DNA损伤和氧化应激，并引发细胞死亡的凋亡途径。根据通过作用机制对化学治疗剂的分类，阿霉素被认为是抗代谢物，因为它能与DNA和蒽环类的细胞毒性抗生素插入，因为它影响拓扑异构酶II酶。

基于早期的研究，提出了在碳纳米材料(CNMs)的基础上创建用于靶向递送药物、生长因子和生物活性物质的碳-蛋白质构建体的假设。

图2

实验方法

通过HF处理从金属/催化剂中纯化UDDs和OLCs。从碳纳米材料中消除无定形碳是通过在450–500°c的空气中氧化实现的。这种纯化方法非常简单：含有UDD和OLC的粗样品与氧气(来自空气)反应，产生二氧化碳或一氧化碳。在450–500°c温度下，催化剂载体的HF(水溶液)溶液在空气中氧化后，会产生一定量的积碳。该程序使用了一个气流石英管式反应器，持续130–150分钟。我们在以前的工作中分析和描述了获得的UDD和OLC的物理和化学特性。

下一步，纯化的碳纳米材料(CNMs)在70 % HNO中氧化3在99℃下4小时，然后用蒸馏水和10 % NH洗涤4结果，合成了碳纳米材料氧化物：超分散金刚石氧化物(UDDox)和洋葱状碳氧化物(OLCox)。之后，用dH洗涤CNMs三次2CNM表面上的酸性位点用0.1 M HCl溶液再生。所得氧化的CNMs-ox通过离心分离，彻底冲洗，并重新悬浮在去离子水中。

图3

下一步的任务是将DOX盐酸盐，固定在UDDox或OLCox颗粒(UDD-DOX或OLC-DOX)的表面。为了通过含氨基的DOX-乳糖一水合物使氧化的CNMs和UDDox/OLCox (200 mg)的表面功能化，将它们与双功能连接试剂一起孵育—N环己基N室温下15分钟内的′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(图.4)。

之后，将58mg DOX-乳糖一水合物加入到10ml pH 6.5的0.15 M磷酸盐缓冲液中。让混合物在30℃反应24小时。在这种条件下，DOX和CNMs之间形成共价键(图。5).通过以10，000 rpm离心15分钟收集组合物，并用dH洗涤2三次。上清液用于通过分光光度计检测游离DOX的浓度。

图4A方案显示了碳二亚胺活化羧基的机理。该反应在室温下进行了15 min

通过FT-IR光谱研究所得组合物的化学组成。红外光谱由FTS 7000e Varian FTIR光谱仪测定。通过在研磨机中研磨约1 mg纳米材料和150 mg光谱纯KBr的混合物来制备分析样品。使用压力为3.0–3.5×10的压机制备样品3千克/厘米2。初步获得KBr的预拍摄光谱，然后从样品的光谱中减去它们。UDD、DOX和UDD-DOX的所有光谱都是用同样的技术记录的。所有物质的处理、样品制备和成分条件都是相似的。

为了监测固定在CNMs上后游离DOX的量和DOX释放的有效性，使用了游离DOX在495 nm波长下发荧光的能力。DOX的活性浓度为16.7 %w/w从3.34毫克/毫升到16.3微克/毫升。为了绘制校准线，将DOX Teva 20 mg/ml稀释至8 × 10倍−3毫克/毫升。然后，通过分光光度板读数器Multyscan (Labsystem，芬兰)测量DOX与UDD和OLC的复合物上清液中游离DOX的荧光。

图5A方案显示了阿霉素通过蛋白共价连接结合到UDD或OLC表面的机制。试剂在30°C下相互作用24小时

对于DOX固定，使用25 mg的UDDox或OLCox。DOX-TEVA的量是在1毫升dH中2.25毫克(0.75毫克活性DOX)2O.反应后上清液中游离DOX的量对于OLC-DOX为14.3 μg或1.9 %，对于UDD-DOX为10.2 μg或1.4 %。因此，我们得出结论，在1 ml dH中，735.7μg DOX固定在25mg OLCox上，739.8μg DOX固定在25mg UDDox上2O.官能化的效率是2.94 %w/w对于OLC-DOX和2.98 %w/w为了UDD-DOX。UDD-DOX和OLC-DOX浓度的进一步计算基于这些数据。

枫树(图6)是一种沉积技术，源自脉冲激光沉积(PLD ),以避免激光辐射对生物或有机分子或化合物造成损伤。这种结果是通过从包含待沉积在挥发性基质中的客体材料的冻结靶进行激光沉积而实现的。作为特定的MAPLE特性，基质的存在保护客体材料免受激光辐射的损害，但是沉积基本上是无溶剂的，因为基质分子不会到达基底。这允许使用相同溶剂的多层沉积和在可溶性基底上的沉积。

图6基质辅助脉冲激光蒸发技术的方案显示了蛋白质在碳表面沉积的原理。

(一)通过将枫木基材(显微镜盖玻片)放置在装有无菌盐溶液(来自Fresenius Kabi的9 mg/ml NaCl水溶液)的5mm深容器的底部，并让水在95℃和大气压下蒸发约12小时，在枫木基材上形成可溶层。

(二)含有所需纳米粒子的层(OLC-DOX或UDD-DOX，见表1详细情况)通过利用MAPLE技术的无溶剂特性沉积在可溶层的顶部。通过将纳米颗粒分散在水溶液或盐溶液中获得MAPLE靶。通过将靶与液氮热接触来冷冻靶。然后降低真空室压力并打开激光器。激光束以45°角照射在靶上，在沉积过程中，靶由计算机控制的平移系统移动，以避免过热和钻孔:面积约为2 cm2被扫描一次或多次，取决于脉冲的总数。

表1枫木沉积参数

(三)被包含OLC/UDD-DOX纳米颗粒的第二层覆盖的可溶层被用作抗EGFR抗体的第二次MAPLE沉积的基质。目标是客体化合物EGFR或EGR的盐溶液，通过与液氮热接触而冻结。枫叶沉积(沉积参数详见表1)再次确保先前的层没有被损坏或移除。

(四)最后，将在可溶性基质上得到多层沉积的显微镜盖玻片浸入作为溶剂的盐溶液中。可溶性底物溶解，纳米颗粒层分解成单个的抗体-OLC/UDD-DOX单元。

☾↢CNMs的细胞毒性↣☽

使用MTT试验评估DOX、UDD-DOX和OLC-DOX对MCF-7和HT29肿瘤细胞的细胞毒性。MTT试验基于活细胞中NAD(P)H依赖性线粒体氧化还原酶将3-[4，5-二甲基噻唑-2]-2，5-二苯基四氮唑盐转化为法马桑晶体。T. Mosmann描述了方案。

简而言之，1 × 104将MCF-7或HT29接种在96孔板中，并在完全培养基中培养12小时。然后，将当前培养基替换为含有DOX、UDD-DOX和OLC-DOX的培养基。在完全培养基中培养的细胞用作对照。孵育24小时后，通过比色测定用MTT分析细胞。向100 μl细胞悬液中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml PBS，适马)。

之后，细胞在标准条件下用MTT孵育4小时。然后，将样品在1500 g下离心5分钟，并提取上清液。总之，向孔中加入10 μl用于MTT晶体稀释的DMSO(适马)和20μl 25mM甘氨酸。在分光光度板读数器Multyscan (Labsystem，芬兰)上在540 nm处测量反应溶液的吸光度。在CNMs的测试浓度范围内的细胞生存力由以下方程确定:

☾↢夹心ELISA↣☽

夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测量两层抗体(即捕获和检测抗体)之间的抗原量。待测抗原必须包含至少两个能够与抗体结合的抗原位点，因为至少两个抗体在“三明治”中起作用(图。7).在这项工作中，使用了美国适马抗体生产商和德国Calbiochem推荐的方案。作为捕获抗体，我们使用兔单克隆抗表皮生长因子(EGF)抗体。

图7夹心ELISA法方案

使用小鼠多克隆抗EGF作为检测抗体。为了可视化，选择山羊抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物作为第二抗体。由美国适马购买的EGF人重组体(SRP 3027，美国适马)用作抗原。作为底物，我们使用3，3，5，5-四甲基联苯胺。检测×10浓度的抗体是MAPLE沉积在UDD-DOX或OLC-DOX膜(C37和C47样品)上的目的。对于样品C36和C46中的MAPLE沉积，使用兔单克隆抗EGF-r抗体。

在UDD/OLC-DOX粒子的盐水和水溶液形式的抗体在基底上的MAPLE沉积之后，将样品浸入盐水(1 ml)中，并通过在旋转振荡器(80 rpm)上在室温下孵育24小时来解析。然后，通过作为检测抗体的反应免疫测定法的ELISA程序来测试抗体的活性。

图8UDD的红外光谱(a)，DOX(b)，以及UDD-DOX(c)

☾↢夹心ELISA↣☽

UDD的主要特征(图8a)对应于在1717 cm区域存在的相当强的碳水化合物键峰−1。它表明羧基的存在。C-O共价带振动的强度也发生了移动和降低，固定在1619-1589cm−1。此外，在样品中，芳族C–H基团的低振动峰(792 cm−1)进行了演示。同时，一些羰基可以从吸附的CO和CO中产生2(在1102和1247厘米处−1，分别)在UDD光谱中。1359厘米处振动的出现−1是UDD存在环状碳团的证据。图5展示了DOX粒子(b)和UDD-DOX粒子(c)的傅里叶变换红外光谱。即使在纳米材料的几个洗涤和离心循环之后，它也显示出来自UDD和DOX的特征性选择。

图9与胰蛋白酶在37.0°C的黑暗中孵育24小时后，UDD-DOX和OLC-DOX偶联物的裂解和游离阿霉素的释放。

☾↢在盖玻片上放置纳米材料、DOX和抗体↣☽

另一个严重限制抗癌药使用的问题是非特异性毒性。化疗与大量药物渗漏到体循环和非特异性分布到健康组织有关。结果，化疗与严重的心脏、神经元、肝脏、肾脏和骨骼毒性相关。因此，靶向输送抗癌药物的任务仍然是实际的，并且还没有解决。组织特异性抗体的应用被认为是解决这一问题的可能途径之一。乳腺癌的肿瘤细胞(MCF-7细胞系)的特征在于EGF的高分泌和EGF受体的过表达。EGFR被广泛用作恶性生长诊断的标记。这就是为什么，EGFR是化疗药物特异性递送的有希望的靶标。考虑到这一点，任务是找到一种方法将复杂的蛋白质分子放置在碳表面，同时不破坏其三级结构和功能活性。因此，MAPLE技术被用于EGFR抗体在UDD-DOX或OLC-DOX表面的沉积(图10)。

图10为EGF-抗体-UDD-DOX偶联物的结构示意图。

☾↢通过ELISA验证抗EGF活性的抗体↣☽

为了确定在碳表面上MAPLE沉积过程后抗体的活性，我们使用了两种类型的抗体:C36和C46——来自兔的抗人EGFR的抗体，以及C37和C47——来自小鼠的抗人EGF的抗体(表2).通过夹心ELISA分析所有样品的活性。

表2枫树沉积样品中抗体的描述

样品C36和C46用作阴性对照，因为它们不参与ELISA反应。未通过MAPLE放置过程的EGF小鼠抗体用作对照样品。人表皮生长因子用作ELISA检测的活性底物。结果，在置于样品C37和C47中后，抗EGF抗体的结合活性略有下降。

与对照组相比，C36样品中的抗体活性降低了18–22%。在C46样本中，抗体活性下降了11–12%(图.11)。同时，C36和C46样品中的阴性对照非特异性结合提供了3 %的实验误差。可能由于ELISA方案中的牛血清白蛋白而出现非特异性结合，并说明了与对照样品的实验偏差的可靠程度。然而，在C37和C47样品中产生的抗体活性相当高，在MAPLE沉积后约为75 %。样品C36和C46将用于进一步实验中免疫组织化学染色中MAPLE放置后抗体活性的后续测试。作者意识到，只有在通过不同方法进行综合分析之后，我们才能对所提出的将抗体放置在碳膜表面的方法的有效性做出结论。

图11夹心酶联免疫吸附试验中MAPLE沉积后抗EGF抗体的活性

碳-DOX偶联物与胰蛋白酶孵育后的细胞毒性

在肝细胞癌(HT29)和乳腺腺癌(MCF-7)的单层细胞培养物上，体外评价了从NCPCs释放后的DOX的细胞毒性。为了测试，形成了九个组。1 × 104将/孔肿瘤细胞(MCF-7或HT29)接种在96孔板中。将细胞在完全培养基中孵育24小时。之后，将培养基更换为无血清和胰蛋白酶。然后，UDD-DOX或OLC-DOX被加入到细胞培养中。

在标准条件下培养细胞24小时后，通过MTT测定法测量生存力。为了评估纯胰蛋白酶在实验中可能的细胞毒性影响，加入了胰蛋白酶对照组。无血清DMEM中胰蛋白酶的浓度如表所示3。图12显示即使高浓度的胰蛋白酶(125，250 μg/ml)也不会导致对肿瘤细胞生存力的统计学显著影响。

这是可能的，因为培育期相当短暂。对此事实的另一个解释是肿瘤细胞对缺乏营养物(FBS)和细胞毒性剂(胰蛋白酶)的抗性增加。

表3实验组培养基组成

同时发现，增加胰蛋白酶和NCPCs的浓度与肿瘤细胞存活率的降低相关。在第1组中，在最低浓度的胰蛋白酶(31.25 μg/ml)和NCP cs(84–2.5μg/ml)下，肿瘤细胞存活水平最高(从90%到66 %，取决于组)。

另一方面，NCPCs和胰蛋白酶浓度的增加导致两种细胞系中肿瘤细胞活力的降低。值得注意的是，肿瘤细胞的敏感性依赖于活性成分的浓度和缀合物中碳的类型。总的来说，UDD-DOX缀合物比OLC-DOX更具细胞毒性。此外，乳腺癌细胞MCF-7比HT29细胞对NCPCs-DOX(UDD-DOX和OLC-DOX)的作用更敏感。

例如，在与UDD-DOX孵育的情况下，腺癌细胞的存活率从52%降低到28 %（图.12）第1-4组，UDD-DOX MCF-7组)和72-30%的OLC-DOX（图.12）第一至第四组，OLC-DOX-MCF-第七组)。肝细胞癌细胞(HT29)似乎对DOX不太敏感。在与UDD-DOX孵育的情况下，增加胰蛋白酶和NCPCs-DOX的浓度与细胞活力从69%下降到56 %相关和91-75%的情况下与OLC-DOX孵化。

图12碳蛋白复合物UDD-D-OX和OLC-DOX孵育后，肿瘤MCF-7和HT29细胞在浓度为1×104细胞/ml的HT29细胞的存活。

结论

基于超分散金刚石、洋葱状碳、抗癌药(DOX)和抗EGFR抗体的碳蛋白构建体的合成显示了化学和生物学的卓有成效的合作。通过逐步合成、清洗、氧化、用含氧酸性基团(羧基COOH、羟基-OH)功能化，以及将DOX固定在UDDox和OLCox的碳表面上，已经开发了新的DOX递送载体。官能化的效率是2.94 %w/w对于OLC-DOX和2.98 %w/w为了UDD-DOX。

这里，描述了在用胰蛋白酶孵育UDD-DOX和OLC-DOX缀合物后，游离DOX浓度的剂量依赖性、阶梯式增加。证明了胰蛋白酶作为DOX释放剂和UDD/OLC-DOX颗粒作为药物递送纳米系统的有效性。此外，本文还表明，胰蛋白酶介导的DOX释放与肿瘤细胞活力呈剂量依赖性负相关。在与浓度从8.4-2.5微克/毫升到670-20微克/毫升的UDD-DOX一起孵育24小时的情况下，腺癌细胞(MCF-7)的存活率从52%降低到28 %，在与OLC-DOX一起孵育相同时间和相同浓度后，从72%降低到30 %。

肝癌细胞(HT29)对DOX的敏感性高于MCF-7。该数据说明寻找合适的药物和递送系统可能是非常复杂的过程，即使对于相同上皮起源的细胞也是如此。为此，测试了通过MAPLE技术在碳表面沉积特异性抗EGF抗体的可能性。MAPLE沉积和PBS后抗EGF抗体的生物活性接近75 %，这取决于沉积技术和碳膜的类型。因此，基于这些结果，我们假设基于UDDs和OLCs的负载药物和特异性抗体的NCPCs可用于有效的抗肿瘤剂递送。