eLife：饶毅团队最新进展，确定了一种新的神经递质

导读神经信号传导依赖于神经元和目标细胞之间的化学传递，神经传递依赖于化学物质，如神经递质、神经调节剂和神经肽等。在一种分子被确定为一种经典的神经递质之前，通常涉及数十年的工作，有时还会涉及复杂的通路。1914 年，Henry Dale 及其同事发现乙酰胆碱（Ach）和副交感神经刺激的相似性，但直到 1929 年才在体内发现 ACh，1934 年 ACh 才被证明是外周神经系统（PNS）中的一种神经递质。在 PNS 中确定一个作为神经递质的分子并不容易，要确定一个中枢神经系统（CNS）的神经递质就更难了。从 ACh 被证明是一种 PNS 神经递质，到它被确定为 CNS 神经递质，花费了 30 年。而如果一种神经递质只在中枢神经系统起作用，而不在 PNS 中起作用，则很难发现或证明。从 2011 年开始，饶毅团队就一直在哺乳动物大脑中积极寻找新的神经递质。迄今为止，研究人员已经发现了包括谷氨酸、氨基丁酸、乙酰胆碱和 5-羟色胺（5-HT）在内的递质。但更重要的是，作者在突触囊泡（SVs）中可重复检测到肌酸（Cr）。Cr 长期以来一直被认为是肌肉和大脑中的能量缓冲器。Cr 缺乏综合征（CDS）是先天性的 Cr 代谢错误，可由三种基因之一的缺陷引起：胍苷乙酸甲基转移（GAMT）、精氨酸甘氨酸氨基转移酶（AGAT）和 SLC6A8，它们都显示出脑部疾病，这表明 Cr 在脑部功能上的重要性。2023 年 12 月 21 日，北京大学/首都医科大学饶毅团队在 eLife 杂志在线发表题为 Suggestion of creatine as a new neurotransmitter by approaches ranging from chemical analysis and biochemistry to electrophysiology 的文章，在这项研究中，他们首先从小鼠大脑中进行了生化纯化，发现了 Cr 的存在，以及典型的神经递质 Glu、GABA、ACh 和 5- HT 的存在，而当 Slc6a8 基因或 Agat 基因被敲除后，Cr 水平显著降低。随后，他们借助包括生物化学、遗传学和电生理学在内的多种方法证明了 Cr 是一种新的神经递质。图片来源：eLife主要研究内容小鼠脑 SVs 中 Cr 的检测为了检测和量化存在于纯化的突触囊泡中的候选递质，研究人员使用了优化的毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）他们发现，使用抗-Syp 抗体免疫沉淀的 SVs 中，Glu、GABA、ACh 和 5- HT 等经典神经递质的水平显著高于 IgG 对照组。与以前的报告一致，仅在 0℃ 附近免疫分离的 SVs 中观察到显著富集的神经递质，而在室温下纯化的则没有。在相同条件下，他们还检测了 SVs 中的 Cr，其含量约为 Glu 的 2%，GABA 的 19%，ACh 的 266%，5- HT 的 3573%。假设单个 SVs 中每一种神经递质的含量相似，从上述数据推断，小鼠大脑中大约 1.3-2.15% 的神经元是肌酸能的。此外，与接近 0°C 时免疫分离的 SVs 相比，室温下纯化的 SVs 中 Cr 显著减少，这支持了 Cr 在 SVs 内部而不是外部的存在。图片来源：eLife缺乏 Slc6a8 和 Agat 的小鼠突变体 SVs-Cr 减少Slc6a8 位于 X 染色体上，编码 Cr 的转运体，其功能缺失（LOF）突变导致人类和小鼠行为缺陷。为了研究 Slc6a8 是否影响 SVs 中的 Cr，他们生成了 Slc6a8 敲除（KO）小鼠。与之前的报道一致，Slc6a8 KO 小鼠体重降低，但其脑重量与 WT 组无显著差异。当他们检测抗-Syp 抗体分离的 SVs 与对照 IgG 的含量时，只有 Cr 显著降低，而经典神经递质没有显著降低。同时，他们的数据也表明 Slc6a8 KO 小鼠 SVs 中 Cr 的特异性降低不太可能是由于技术因素所致。使用相似的策略，他们的实验结果也表明 Agat 的缺乏也会使小鼠 SVs 中 Cr 的显著降低。图片来源：eLife在受到刺激时，钙离子依赖性的 Cr 释放经典的神经递质在刺激后会以 Ca2+ 依赖的方式从 SVs 释放到突触间隙。例如，高细胞外 K+ 刺激脑片中谷氨酸、GABA 和其他神经递质的 Ca2+ 依赖性释放。基于小鼠大脑冠状切片，他们通过记录切片中的神经元来监测 K+ 刺激的效果。结果发现，K+ 刺激后，海马锥体神经元立即去极化，触发一系列动作电位，在不到 1 分钟的时间内达到了一个较大的去极化平台。K+ 诱导的去极化持续了几分钟，然后回到基线。在 Ca2+ 存在的情况下，细胞外 K+ 水平升高的去极化导致 WT 小鼠切片中 Glu 和 GABA 的强劲释放。此外，K+ 升高的去极化也会导致 Cr 的强劲释放，而且 Cr 以 Ca2+ 依赖的方式释放，在 2.5 mM Ca2+ 存在时，K+ 刺激释放的 Cr 多于 Ca2+ 不存在时的 Cr。随后，他们还检测了 Slc6a8 和 Agat 突变是否影响 K+ 诱导的 Cr 的释放。结果发现，虽然 Slc6a8 KO 小鼠切片中 Glu 和 GABA 的释放水平与 WT 小鼠没有显著差异，但 KO 小鼠在 K+ 刺激下的 Cr 释放显著减少。与之相似，Agat 基因的敲除也会选择性地降低 K+ 诱发的 Cr 释放，但对 Glu 或 GABA 的释放没有影响。图片来源：eLifeCr 进入突触小体依赖 Slc6a8随着酶的降解，转运体的再摄取是清除释放到突触间隙的神经递质的重要途径，由于突触体包含神经传递装置，它们经常被用于研究神经递质的摄取。为了研究 Cr 摄取到突触小体是否需要 Slc6a8，他们首先证实了 Slc6a8 存在于突触小体中。接下来，他们研究了 Slc6a8 是否参与了突触小体对 Cr 的摄取。结果发现，与对照组相比，Slc6a8 敲除小鼠突触体中 Cr 的摄取减少到 WT 小鼠的 1/3 左右。因此，Slc6a8 是突触小体吸收 Cr 的必要条件。此外，他们还发现 Cr 能够以 ATP 依赖的方式运输到 SVs 中。图片来源：eLife结语综上所述，在本研究中，他们结合了生物化学、电生理学、免疫染色等方法，提出并支持了肌酸（Cr）在中枢神经系统可能作为神经递质。研究人员首先在突触囊泡中检测到肌酸的存在，其水平低于谷氨酸和氨基丁酸，但高于乙酰胆碱和 5-羟色胺。此外，在缺乏精氨酸甘氨酸氨基转移酶（一种 Cr 合成酶）或 Slc6a8 的小鼠中，SVs-Cr 减少。刺激脑组织后，他们还检测到 Cr 的钙依赖性释放，不过在 Slc6a8 和 Agat 突变体中 Cr 的释放减少。总之，该研究对 Cr 作为一种新型神经递质的潜在作用提出了有价值的参考，为 SVs 中存在 Cr 提供了确凿的证据。在未来，如果能够发现一种受体，它将支持 Cr 通过突触释放并与突触后受体结合的假说，而这也必将引起神经科学领域的广泛兴趣。题图来源：站酷海洛参考文献：1. Bian X, Zhu J, Jia X, Liang W, Yu S, Li Z, Zhang W, Rao Y. Suggestion of creatine as a new neurotransmitter by approaches ranging from chemical analysis and biochemistry to electrophysiology. Elife. 2023 Dec 21;12:RP89317. doi: 10.7554/eLife.89317.2. Bradberry MM, Mishra S, Zhang Z, Wu L, McKetney JM, Vestling MM, Coon JJ, Chapman ER. 2022. Rapid and Gentle immunopurification of brain synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience 42:3512–3522.3. Qian C, Wu Z, Sun R, Yu H, Zeng J, Rao Y, Li Y. 2021. Localization, proteomics, and metabolite profiling reveal a putative vesicular transporter for UDP-glucose. eLife 10:e65417.

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