丙烯醛-丙氨酸加合物制备与细胞毒性

丙烯醛是α、β-不饱和醛中最简单且活性最高的小分子醛，广泛存在于热加工食品（如咖啡、酒、油炸土豆等）和环境（因工业排放、有机物不完全燃烧等原因产生）中。同时，丙烯醛也是一种内源性代谢产物，髓过氧化物酶介导的苏氨酸降解、胺氧化酶介导的精胺和亚精胺降解均会生成丙烯醛；抗癌药物环磷酰胺在体内通过细胞色素P450酶将其转化生成丙烯醛；细胞膜内自由基引发的多不饱和脂肪酸过氧化中也会生成丙烯醛。

半胱氨酸属于含硫氨基酸，其巯基极易与丙烯醛发生迈克尔加成反应，但氨基酸中氨基的反应活性及其与丙氨酸形成的加合物鲜见研究。丙氨酸是仅次于甘氨酸的最简单氨基酸，在马铃薯和面粉中的含量显著高于甘氨酸。暨南大学理工学院的邹照佳、郑 洁、欧仕益*等人选择丙氨酸作为丙烯醛的清除剂，通过阐释其加合物的结构及其反应机理，以期为控制食品中的丙烯醛毒性提供一种新策略。

1、丙烯醛清除率

实验中丙烯醛标准曲线方程为y＝0.0258x-0.0855，R2＝0.9887（其中x代表丙烯醛质量浓度，y代表吸光度）。根据该标准曲线，获得对照组和实验组的丙烯醛清除率如表1所示，相比于对照组，实验组在90 min后的丙烯醛消除率即接近80%，说明丙氨酸对丙烯醛有较高的清除能力。

2、加合物的分离纯化

采用不同浓度比的丙烯醛与丙氨酸反应，发现产物中除丙氨酸外，还出现一个峰面积较大的新产物 （图1A）。其中，丙烯醛与丙氨酸浓度比为1∶2，在50 ℃反应5 h后，新产物的峰面积最大，因此以此为最佳反应条件制备加合物。

经反相硅胶层析柱细分离后的目标加合物用HPLC法检测，色谱结果如图1B所示。纯化后目标加合物的保留时间为5.926 min（图1B），经紫外全波长扫描，目标产物的最大吸收波长是220 nm（图1C）。根据 图1B峰面积积分计算得出纯化后获得的目标加合物纯度可达95%以上。

3、目标加合物的结构鉴定

纯化后的目标产物经高分辨质谱法检测结果如图2所示。该物质相对分子质量为183.0823，分子式为C9H13NO3。

纯化后的目标加合物经LC-MS分析所得的一级、二级质谱如图3所示，从一级质谱图可以看到明显的 [M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+峰（图3A），再次确定了加合物相对分子质量为183，且二级质谱图中脱羧峰 [M-45]+（图3B）的存在以及较少的碎片离子峰表明目标加合物中仍存在一个完整的羧基，化合物结构相对稳定。

目标加合物的13C NMR、1H NMR图谱如图4所示，根据13C NMR和Dept-135 NMR分析可得：δ193.69（—CHO）， δ149.11、δ133.54（环内—CH＝C—），δ45.46 （环内—N—CH2—C—），δ48.87（环内—N—CH2—CH2—），δ23.8（环内—CH2—C—），δ173.64（-COOH）。 根据1H NMR分析可得：δ9.45s（-CHO）、δ7.32m（环内 —CH＝C—）、δ4.79（D2O）、δ1.57d（—CH3）。

4、加合物的细胞毒性

本研究选取人正常胃上皮细胞对丙烯醛和加合物的毒性进行探索。结果表明，丙烯醛和加合物的细胞毒性存在显著差异（图6）。GES-1细胞活力随着丙烯醛浓度的增加急剧降低，在丙烯醛浓度达到0.06 mmol/L时细胞的存活率仅为38.9%（24 h）、32.2%（48 h），且随着浓度的增加细胞的存活率基本上没有发生改变，说明在浓度达到0.06 mmol/L甚至更高时，细胞已经基本死亡，丙烯醛的毒性具有很强的剂量依赖性。由图6可知，加合物浓度高达2 mmol/L时，24 h后GES-1细胞的存活率依然保持在60%以上，毒性明显低于丙烯醛的毒性。但延长培养时间至48 h后，增加加合物浓度开始显现出细胞毒性，1 mmol/L时细胞存活率出现明显降低，但细胞存活率依然保持40%以上。综上所述，在实验设置的浓度范围内，丙烯醛对GES-1细胞生长有较大的抑制作用，较低浓度的丙烯醛就可导致细胞存活率快速下降，而加合物在低浓度时对GES-1细胞生长没有抑制作用，但高浓度、较长时间（48 h）处理会抑制GES-1细胞生长。

结 论

本研究制备并分离纯化出了一种丙氨酸-丙烯醛加合物。经HPLC检测该加合物最大吸收波长为220 nm，经分离 纯化后，确定该加合物的相对分子质量为183.0823，结构为一分子丙氨酸与两分子丙烯醛先经过迈克尔加成反应再通过羟醛缩合生成一个含氮六元环的稳定结构。加合物的形成大大降低了丙烯醛的细胞毒性，以加合物和丙烯醛孵育GES-1细胞24 h和48 h后，加合物的IC50分别是丙烯醛的56.7、12.9 倍，说明丙氨酸可作为丙烯醛的清除剂。但是，随着加合物孵育时间的延长，高剂量加合物的细胞毒性增加，其机理有待进一步研究。

本文《丙烯醛-丙氨酸加合物制备与细胞毒性》来源于《食品科学》2021年42卷9期1-6页，作者：邹照佳，郑洁，黄才欢，刘付，欧仕益。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200410-141。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

近期研究热点

基于牛乳非蛋白生物标志物定量检测山羊乳中掺加的牛乳

三文鱼中晚期糖基化终末产物含量测定及产地特征因子分析

基于高光谱和超声成像技术的原切与合成调理牛排鉴别

基于支持向量机对云南常见野生食用牛肝菌中红外光谱的种类鉴别

上海进口水产品中副溶血性弧菌耐药性、毒力基因和遗传特征

UPLC-MS/MS法同时检测食品中3 种主要牛奶过敏原

高效液相色谱-串联质谱法对烤鸭皮色素的组成和结构分析

蛹虫草中新化合物的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性

虾青素微球对酸奶品质与风味的影响

预处理方式对鳙鱼骨蛋白酶解液游离氨基酸和挥发性成分的影响

黄金茶工夫红茶的甜味量化及其与主要滋味物质相关性分析

超声辅助浊点萃取-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中天然VK同系物

基于高通量测序对茅台镇酱香白酒主酿区霉菌菌群结构多样性的解析

滩羊肌肉在煮制过程中可挥发性化合物的变化

产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

产低温蛋白酶动性球菌的筛选及其在低盐鱼露发酵中的应用

芦丁诱导猪肉肌原纤维蛋白结构变化对蛋白凝胶特性的改善作用大豆油和预乳化大豆油对金线鱼鱼糜凝胶品质的影响

核桃低聚肽对大鼠胃黏膜损伤的保护作用

肉桂精油对小鼠肝肠组织抗氧化能力以及肠道菌群结构的调节作用

玉木耳多糖对杂粮粥糊化、流变及老化特性的影响

肉桂精油对小鼠肝肠组织抗氧化能力以及肠道菌群结构的调节作用

玉木耳多糖对杂粮粥糊化、流变及老化特性的影响

明胶与海藻酸钠的静电复合机制及热动力学分析

血浆胺氧化酶交联明胶及其产物结构表征与性能分析

湿腌时盐质量浓度对草鱼肌肉组织结构和品质的影响

包封姜黄素的果胶-核桃蛋白复合物乳液稳定性及体外消化

不同冷却温度添加氯化镁和谷氨酰胺转氨酶对大豆全粉凝胶流变性质的影响

二氢杨梅素对煎烤鱿鱼片贮藏过程中氧化三甲胺降解及品质的影响

微冻贮藏对牛肉保水性的影响

基于蛋白质组学技术研究秦川牛肉宰后贮藏过程中肌红蛋白含量及其衍生物转化

冻融循环对大目金枪鱼质构与蛋白质特性变化的影响3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白功能特性变化

‘印度青’苹果合成与分解代谢通量研究及贮藏温度的优化黑蒜对溃疡性结肠炎BALB/c小鼠炎症反应的影响

酶法改性淀粉颗粒的研究进展

n-3多不饱和脂肪酸对小鼠血液外泌体中miRNA的调节和抑制肥胖作用

基于食品大分子结构组装的载铁复合物研究进展

硒化蒲公英多糖的制备、结构表征及益生菌促增殖活性

Pickering乳液稳定机理及其在食品中的应用研究进展

人参皂苷Rh2-壳聚糖纳米粒子制备及对A549细胞的抑制作用

乳铁蛋白生物活性肽及其功能机制研究进展

桑叶生物碱对氧化应激小鼠糖脂代谢异常及肝损伤的改善作用

食物致敏原表位定位技术的研究进展修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅图片来源于文章原文及摄图网